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技术资料/正文
阅读质粒图谱
1139 人阅读发布时间：2020-09-04 12:00
阅读质粒图谱
1、抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如 Amp+l ,Kan+
2、多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段 l
3、P/E 启动子/增强子 l
4、Termsl 终止信号
5、加 poly（A）信号 l 可以起到稳定 mRNA 作用
二. 质粒三大件
复制子ori、多克隆位点、选择性标记（抗性基因）
1、复制子：顾名思义，是质粒自己复制，放飞自我的地方，标识有Ori (origin)字。 常见有pBR322, pUC, pMB1 等类型，也是双向复制的。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。
还有一种特殊的ori：f1 ori，即f1噬菌体复制子，它只能合成单链（正义链）
2、多克隆位点（multi-clonal site，MCS)
一段约50-100bp左右的序列，上面限制性内切酶位点扎堆。可以插入外源基因，实现外源基因表达。
3、抗性基因 细菌的获得性耐药性，往往是质粒带来了抗性基因。一般有如下基因
（1）Ampr：抗氨苄青霉素，R表示resistance。产物可水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr ：可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr：解氯霉素毒性。
（4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素）失活。
（5）hygr：使潮霉素失活（农杆菌常用）。
质粒的抗药性也方便了后面的阳性克隆筛选，转染了质粒的阳性菌可以在抗生素培养基上生长。
三、方向和标签
多数质粒图谱有箭头，如果是从启动子（P）开始的，一般表示转录方向；如果从ori开始，表示复制的方向。
启动子怎么看呢？启动子以P开头，代表promotor。常见的有CMV、EF1（启动长片段的）（CMV是什么，在下图中找）；H1、U6（启动短片段的，比如shRNA）；35S（植物质粒常用）
pA: 表示转录终止位点poly A
四、多克隆位点MCS
根据功能，质粒有克隆型和表达型。如果是用来表达蛋白质的，在MCS上游一般有强启动子，如上图中T7启动子。T7启动子专一受控于T7 RNA聚合酶，启动强度那是相当的高。
外源基因插入在MCS区，为了让表达的蛋白质好分离、好鉴定，一般要加点料。例如上图中Myc epitope(myc抗原表位，10氨基酸）和6His(his6标签）。蛋白质与这两个标签是一条绳上蚂蚱（融合表达），所以可以用myc抗体与western blot来检测外源蛋白表达水平。类似功能的标签还有Flag(8aa）和HA（流感病毒的红细胞凝集素表面抗原，9aa）。
His6就是6个组氨酸的小串串，天然的蛋白中比较少见。它对镍离子天然有好感，用Ni-亲和层析可以将目的蛋白从细胞裂解液中特异性钓出来。类似的标签还有GST（谷胱甘肽巯基转移酶）,MBP(麦芽糖结合蛋白），都可以用亲和层析分离。
有的质粒还含有荧光蛋白标记，如GFP, mCherry, 可以让宿主细胞发荧光！
五、多克隆位点序列
质粒图谱一般会有MCS的具体序列，即三联体密码+酶切位点。这里三联体密码是提示插入序列要按照三联体密码插入，否则会移码突变。5`末端如果有差异的话，可以把基因的ATG（甲硫氨酸）的5`末端替换1-2个碱基，从第二个氨基酸序列开始完全一致即可。
下图是毕赤酵母表达载体，大小为3593 bp。它属于整合型载体（将DNA整合到毕赤酵母基因组上以实现表达），并可将目的蛋白分泌到胞外。
AOX1 promoter：甲醇诱导型启动子，表明载体需要甲醇诱导才可表达α-factor secretion signal：分泌信号肽，使得目的基因表达的蛋白分泌到胞外。
AOX1 terminator：转录终止子
TEF1 promoter：EF-1α启动子，在真核细胞中启动抗性结合蛋白的表达
EM7 promoter：细菌启动子。在原核细胞中启动抗性结合蛋白的表达
BleoR：Zeocin（博来霉素）抗性基因
CYC1 terminator：转录终止子
下图是腺病毒穿梭质粒pShuttle
它有GFP荧光标签，有IRES (internal ribosome entry site,内部核糖体结合位点)，它作用是核糖体翻译到这里时，不会与mRNA脱离，而是嗖的一下滑过去，继续表达下面的GFP。也就是GFP表达了的话（细胞绿色荧光），MCS中的外源基因也翻译了
END
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- 载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
1、抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如 Amp+l ,Kan+
2、多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段 l
3、P/E 启动子/增强子 l
4、Termsl 终止信号
5、加 poly（A）信号 l 可以起到稳定 mRNA 作用
二. 质粒三大件
复制子ori、多克隆位点、选择性标记（抗性基因）
1、复制子：顾名思义，是质粒自己复制，放飞自我的地方，标识有Ori (origin)字。 常见有pBR322, pUC, pMB1 等类型，也是双向复制的。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。
还有一种特殊的ori：f1 ori，即f1噬菌体复制子，它只能合成单链（正义链）
2、多克隆位点（multi-clonal site，MCS)
一段约50-100bp左右的序列，上面限制性内切酶位点扎堆。可以插入外源基因，实现外源基因表达。
3、抗性基因 细菌的获得性耐药性，往往是质粒带来了抗性基因。一般有如下基因
（1）Ampr：抗氨苄青霉素，R表示resistance。产物可水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr ：可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr：解氯霉素毒性。
（4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素）失活。
（5）hygr：使潮霉素失活（农杆菌常用）。
质粒的抗药性也方便了后面的阳性克隆筛选，转染了质粒的阳性菌可以在抗生素培养基上生长。
三、方向和标签
多数质粒图谱有箭头，如果是从启动子（P）开始的，一般表示转录方向；如果从ori开始，表示复制的方向。
启动子怎么看呢？启动子以P开头，代表promotor。常见的有CMV、EF1（启动长片段的）（CMV是什么，在下图中找）；H1、U6（启动短片段的，比如shRNA）；35S（植物质粒常用）
pA: 表示转录终止位点poly A
四、多克隆位点MCS
根据功能，质粒有克隆型和表达型。如果是用来表达蛋白质的，在MCS上游一般有强启动子，如上图中T7启动子。T7启动子专一受控于T7 RNA聚合酶，启动强度那是相当的高。
外源基因插入在MCS区，为了让表达的蛋白质好分离、好鉴定，一般要加点料。例如上图中Myc epitope(myc抗原表位，10氨基酸）和6His(his6标签）。蛋白质与这两个标签是一条绳上蚂蚱（融合表达），所以可以用myc抗体与western blot来检测外源蛋白表达水平。类似功能的标签还有Flag(8aa）和HA（流感病毒的红细胞凝集素表面抗原，9aa）。
His6就是6个组氨酸的小串串，天然的蛋白中比较少见。它对镍离子天然有好感，用Ni-亲和层析可以将目的蛋白从细胞裂解液中特异性钓出来。类似的标签还有GST（谷胱甘肽巯基转移酶）,MBP(麦芽糖结合蛋白），都可以用亲和层析分离。
有的质粒还含有荧光蛋白标记，如GFP, mCherry, 可以让宿主细胞发荧光！
五、多克隆位点序列
质粒图谱一般会有MCS的具体序列，即三联体密码+酶切位点。这里三联体密码是提示插入序列要按照三联体密码插入，否则会移码突变。5`末端如果有差异的话，可以把基因的ATG（甲硫氨酸）的5`末端替换1-2个碱基，从第二个氨基酸序列开始完全一致即可。
下图是毕赤酵母表达载体，大小为3593 bp。它属于整合型载体（将DNA整合到毕赤酵母基因组上以实现表达），并可将目的蛋白分泌到胞外。
AOX1 promoter：甲醇诱导型启动子，表明载体需要甲醇诱导才可表达α-factor secretion signal：分泌信号肽，使得目的基因表达的蛋白分泌到胞外。
AOX1 terminator：转录终止子
TEF1 promoter：EF-1α启动子，在真核细胞中启动抗性结合蛋白的表达
EM7 promoter：细菌启动子。在原核细胞中启动抗性结合蛋白的表达
BleoR：Zeocin（博来霉素）抗性基因
CYC1 terminator：转录终止子
下图是腺病毒穿梭质粒pShuttle
它有GFP荧光标签，有IRES (internal ribosome entry site,内部核糖体结合位点)，它作用是核糖体翻译到这里时，不会与mRNA脱离，而是嗖的一下滑过去，继续表达下面的GFP。也就是GFP表达了的话（细胞绿色荧光），MCS中的外源基因也翻译了
END
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