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阅读质粒图谱
788 人阅读发布时间:2020-09-04 12:00
阅读质粒图谱
1、抗生素抗性基因 可以便于加以检测,如 Amp+l ,Kan+
2、多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段 l
3、P/E 启动子/增强子 l
4、Termsl 终止信号
5、加 poly(A)信号 l 可以起到稳定 mRNA 作用
二. 质粒三大件
复制子ori、多克隆位点、选择性标记(抗性基因)
1、复制子:顾名思义,是质粒自己复制,放飞自我的地方,标识有Ori (origin)字。 常见有pBR322, pUC, pMB1 等类型,也是双向复制的。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。
还有一种特殊的ori:f1 ori,即f1噬菌体复制子,它只能合成单链(正义链)
2、多克隆位点(multi-clonal site,MCS)
一段约50-100bp左右的序列,上面限制性内切酶位点扎堆。可以插入外源基因,实现外源基因表达。
3、抗性基因 细菌的获得性耐药性,往往是质粒带来了抗性基因。一般有如下基因
(1)Ampr:抗氨苄青霉素,R表示resistance。产物可水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。
(2)tetr :可以阻止四环素进入细胞。
(3)camr:解氯霉素毒性。
(4)neor(kanr):氨基糖苷磷酸转移酶,使G418(卡那霉素)失活。
(5)hygr:使潮霉素失活(农杆菌常用)。
质粒的抗药性也方便了后面的阳性克隆筛选,转染了质粒的阳性菌可以在抗生素培养基上生长。
三、方向和标签
多数质粒图谱有箭头,如果是从启动子(P)开始的,一般表示转录方向;如果从ori开始,表示复制的方向。
启动子怎么看呢?启动子以P开头,代表promotor。常见的有CMV、EF1(启动长片段的)(CMV是什么,在下图中找);H1、U6(启动短片段的,比如shRNA);35S(植物质粒常用)
pA: 表示转录终止位点poly A
四、多克隆位点MCS
根据功能,质粒有克隆型和表达型。如果是用来表达蛋白质的,在MCS上游一般有强启动子,如上图中T7启动子。T7启动子专一受控于T7 RNA聚合酶,启动强度那是相当的高。
外源基因插入在MCS区,为了让表达的蛋白质好分离、好鉴定,一般要加点料。例如上图中Myc epitope(myc抗原表位,10氨基酸)和6His(his6标签)。蛋白质与这两个标签是一条绳上蚂蚱(融合表达),所以可以用myc抗体与western blot来检测外源蛋白表达水平。类似功能的标签还有Flag(8aa)和HA(流感病毒的红细胞凝集素表面抗原,9aa)。
His6就是6个组氨酸的小串串,天然的蛋白中比较少见。它对镍离子天然有好感,用Ni-亲和层析可以将目的蛋白从细胞裂解液中特异性钓出来。类似的标签还有GST(谷胱甘肽巯基转移酶),MBP(麦芽糖结合蛋白),都可以用亲和层析分离。
有的质粒还含有荧光蛋白标记,如GFP, mCherry, 可以让宿主细胞发荧光!
五、多克隆位点序列
质粒图谱一般会有MCS的具体序列,即三联体密码+酶切位点。这里三联体密码是提示插入序列要按照三联体密码插入,否则会移码突变。5`末端如果有差异的话,可以把基因的ATG(甲硫氨酸)的5`末端替换1-2个碱基,从第二个氨基酸序列开始完全一致即可。
下图是毕赤酵母表达载体,大小为3593 bp。它属于整合型载体(将DNA整合到毕赤酵母基因组上以实现表达),并可将目的蛋白分泌到胞外。
AOX1 promoter:甲醇诱导型启动子,表明载体需要甲醇诱导才可表达α-factor secretion signal:分泌信号肽,使得目的基因表达的蛋白分泌到胞外。
AOX1 terminator:转录终止子
TEF1 promoter:EF-1α启动子,在真核细胞中启动抗性结合蛋白的表达
EM7 promoter:细菌启动子。在原核细胞中启动抗性结合蛋白的表达
BleoR:Zeocin(博来霉素)抗性基因
CYC1 terminator:转录终止子
下图是腺病毒穿梭质粒pShuttle
它有GFP荧光标签,有IRES (internal ribosome entry site,内部核糖体结合位点),它作用是核糖体翻译到这里时,不会与mRNA脱离,而是嗖的一下滑过去,继续表达下面的GFP。也就是GFP表达了的话(细胞绿色荧光),MCS中的外源基因也翻译了
END
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- 载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
1、抗生素抗性基因 可以便于加以检测,如 Amp+l ,Kan+
2、多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段 l
3、P/E 启动子/增强子 l
4、Termsl 终止信号
5、加 poly(A)信号 l 可以起到稳定 mRNA 作用
二. 质粒三大件
复制子ori、多克隆位点、选择性标记(抗性基因)
1、复制子:顾名思义,是质粒自己复制,放飞自我的地方,标识有Ori (origin)字。 常见有pBR322, pUC, pMB1 等类型,也是双向复制的。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。
还有一种特殊的ori:f1 ori,即f1噬菌体复制子,它只能合成单链(正义链)
2、多克隆位点(multi-clonal site,MCS)
一段约50-100bp左右的序列,上面限制性内切酶位点扎堆。可以插入外源基因,实现外源基因表达。
3、抗性基因 细菌的获得性耐药性,往往是质粒带来了抗性基因。一般有如下基因
(1)Ampr:抗氨苄青霉素,R表示resistance。产物可水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。
(2)tetr :可以阻止四环素进入细胞。
(3)camr:解氯霉素毒性。
(4)neor(kanr):氨基糖苷磷酸转移酶,使G418(卡那霉素)失活。
(5)hygr:使潮霉素失活(农杆菌常用)。
质粒的抗药性也方便了后面的阳性克隆筛选,转染了质粒的阳性菌可以在抗生素培养基上生长。
三、方向和标签
多数质粒图谱有箭头,如果是从启动子(P)开始的,一般表示转录方向;如果从ori开始,表示复制的方向。
启动子怎么看呢?启动子以P开头,代表promotor。常见的有CMV、EF1(启动长片段的)(CMV是什么,在下图中找);H1、U6(启动短片段的,比如shRNA);35S(植物质粒常用)
pA: 表示转录终止位点poly A
四、多克隆位点MCS
根据功能,质粒有克隆型和表达型。如果是用来表达蛋白质的,在MCS上游一般有强启动子,如上图中T7启动子。T7启动子专一受控于T7 RNA聚合酶,启动强度那是相当的高。
外源基因插入在MCS区,为了让表达的蛋白质好分离、好鉴定,一般要加点料。例如上图中Myc epitope(myc抗原表位,10氨基酸)和6His(his6标签)。蛋白质与这两个标签是一条绳上蚂蚱(融合表达),所以可以用myc抗体与western blot来检测外源蛋白表达水平。类似功能的标签还有Flag(8aa)和HA(流感病毒的红细胞凝集素表面抗原,9aa)。
His6就是6个组氨酸的小串串,天然的蛋白中比较少见。它对镍离子天然有好感,用Ni-亲和层析可以将目的蛋白从细胞裂解液中特异性钓出来。类似的标签还有GST(谷胱甘肽巯基转移酶),MBP(麦芽糖结合蛋白),都可以用亲和层析分离。
有的质粒还含有荧光蛋白标记,如GFP, mCherry, 可以让宿主细胞发荧光!
五、多克隆位点序列
质粒图谱一般会有MCS的具体序列,即三联体密码+酶切位点。这里三联体密码是提示插入序列要按照三联体密码插入,否则会移码突变。5`末端如果有差异的话,可以把基因的ATG(甲硫氨酸)的5`末端替换1-2个碱基,从第二个氨基酸序列开始完全一致即可。
下图是毕赤酵母表达载体,大小为3593 bp。它属于整合型载体(将DNA整合到毕赤酵母基因组上以实现表达),并可将目的蛋白分泌到胞外。
AOX1 promoter:甲醇诱导型启动子,表明载体需要甲醇诱导才可表达α-factor secretion signal:分泌信号肽,使得目的基因表达的蛋白分泌到胞外。
AOX1 terminator:转录终止子
TEF1 promoter:EF-1α启动子,在真核细胞中启动抗性结合蛋白的表达
EM7 promoter:细菌启动子。在原核细胞中启动抗性结合蛋白的表达
BleoR:Zeocin(博来霉素)抗性基因
CYC1 terminator:转录终止子
下图是腺病毒穿梭质粒pShuttle
它有GFP荧光标签,有IRES (internal ribosome entry site,内部核糖体结合位点),它作用是核糖体翻译到这里时,不会与mRNA脱离,而是嗖的一下滑过去,继续表达下面的GFP。也就是GFP表达了的话(细胞绿色荧光),MCS中的外源基因也翻译了
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