摘要：本实验选择使用慢病毒对照病毒，基因过表达 *** 病毒感染 *** 细胞。在感染细胞 72 小时后，通过加入并维持 2ug/ml 的 puromycin 杀死未被有效感染的细胞。从而在 puromycin 药物的维持下最终获得稳定表达的稳定株。

一、实验原理：
外源基因在细胞中的表达可分为两大类，一类是瞬时表达，一类是稳定表达（永.久表达）。前者外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，虽然可以达到高水平的表达，但通常只持续几天。后者外源 DNA 整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的基因。建立稳定细胞株，一般是根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物对靶细胞进行筛选。最常用的抗性标记基因有潮霉素（hygromycin）、新霉素（neomycin）和嘌呤霉素（puromycin），常用 Hygromycin B、G418 和 puromycin 进行选择性筛选。传统的稳定株筛选方法需要通过外源基因的瞬时转染后对靶细胞进行筛选， 最终获得从单一细胞扩增起来的稳定细胞株， 该方法阳性率低，周期长，工作量大。慢病毒是一种 RNA 病毒，携带的外源基因在病毒感染细胞后需要逆转录为 DNA，再整合到宿主细胞基因组以后才能表达。 利用慢病毒必须整合到宿主基因组的特性来筛选稳定株的方法克服了传统方法的弊端，可以在短时间内获得高效率的稳定细胞株。筛选得到的细胞或者可稳定表达目的蛋白，用于蛋白的扩增和富集；或者得到稳定沉默特定基因的细胞株。

二、实验目的：
通过慢病毒感染配合药物筛选的方法获得稳定表达绿色荧光对照和 *** 基因高表达的稳定细胞株。

三、实验材料：
1．细胞株和慢病毒：
对照病毒（生物），*** 病毒；细胞，培养基：1640+10%FBS (四抗)， 5%CO₂ 培养。
2. 主要试剂耗材：
Polybrene; Puromycin；6 孔板）; 60mm dish）; 100mm dish。
3. 主要仪器设备：
荧光显微镜；CO₂ 培养箱；生物安全柜

四、实验步骤：
1．细胞铺板：
将细胞按 30% 汇合度接种到 6 孔板：
1）1.0 细胞配成 7.5×10⁴ cells/ml 细胞悬液，待铺板。 
2）每孔铺 2 mL，即 15×10⁴ cells/well，各铺 1 块 6 孔板。

2．感染慢病毒：
12~20 小时后感染对照病毒和 TLR7 基因过表达慢病毒
（1）加病毒：
加药量计算方法： （细胞数 ×MOI 值 / 病毒原液滴度）×103= 病毒加药量（μl）
浓度及加药量，见表一（MOI 值参照文献细胞 1，MOI=20;细胞 2，MOI=25 进行实验）
 

表 1 

（2）加 polybrene：
每孔加 10μl  1mg/ml polybrene，最终在细胞样品中 polybrene 终浓度为 5μg/ml。
（3）感染 12-20 小时后换培养基：
弃去培养基，PBS 清洗两次，每孔加入 2ml 新鲜的培养基。

3．稳定株筛选
1)72h 以后，加入终浓度 2ug/ml puromycin（该浓度为提前对细胞 1 和细胞 2 进行有效杀伤摸索实验，摸索得出）培养 24h 后，如细胞汇合度低于 30％更换为正常培养基，培养至细胞汇合度 30％以上，更换为浓度 8ug/ml puromycin 新鲜培养基持续培养筛选 2 周；如细胞汇合度不低于 30％，则使用 2ug/ml puromycin 新鲜培养基持续培养筛选 2 周；
2) 药物筛选约两周后，拍荧光照片。
3) 稳定细胞株冻存。

五、实验结果：

结论：
以上结果说明稳定株筛选达到预期结果。

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