LNC 干扰慢病毒技术资料

一、载体构建
1、根据客户提供的序列，进行由 SIRNA 序列转换为 SHRNA 序列
使用载体为 PLKO-EGFP+PURO，图谱如下
附载体图谱如下：（请放大查阅）

2 重组慢病毒载体包装及滴度测定
2.1 重组慢病毒载体 ***   *** 慢病毒慢病毒包装
1、转染前一天，预先准备 1 个 100mm dish 的 293T 细胞，每皿的细胞密度为 5*107 个细胞，培养基为 DMEM + 10% FBS，1% Glutamax ，1% 青霉素-链霉素。 用于包装的 293T 细胞必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率 90% 以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。任何时候细胞汇合率都不准达到 100%。
2、第二天，镜下检查细胞。细胞融合度应大致为 70-80%，分布均匀。
3、转染前 1 小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入 9ml 的 Opti-MEM 培养基，将细胞送回培养箱。
4、取两支无菌的 1.5ml 离心管，其中一支中加入 载体质粒， 包装辅助质粒 pAx2 和 VSVG，用 HBS 补齐到 500μl。另一支中加入 100 μl PEI 溶液和 400 μl HBS，用移液器轻轻混匀。将 PEI 稀释液滴加到质粒管中，边加边轻轻晃匀。
关键步骤：使用 *** 质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒。
5、室温孵育 20 分钟，将得到的混合液均匀滴加入到细胞培养板中，每板 200μl。来回晃动培养板，混匀后放回到 5% 二氧化碳培养箱。
6、6 小时后，移去细胞上清，更换为 9ml 30％FBS 的 DMEM 完全培养基。
7、转染后一天观察细胞，所有的细胞应当都是健康的并且密度接近 80%。
8、将细胞送回培养箱继续培养 48h 后，收集所有的上清，并添加 30％FBS，DMEM 完全培养基，继续培养，于 72h 收集所有上清；
9、4℃，500g 离心 10 分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片。
10、进行收集的病毒液的滴度测定，步骤如下：
 

病毒滴度的测定
滴定法原理：
病毒感染 293T 细胞 48 小时后，使用荧光显微镜（10×10 倍）观察每个梯度感染的荧光细胞数，并选用荧光细胞数接近 50 的梯度，即 104 梯度进行计数，每孔采用 2 个不同视野进行细胞计数，每个待测腺病毒共得到 6 个数值，最后计算平均数，按照公式：滴度 =（荧光细胞数 × 每孔的视野数）/（加入病毒液体积 × 稀释倍数），计算出 ***-shRNA，***-shRNA，EGFP-NC 病毒滴度。每孔的视野数 指 24 孔板每孔的面积 / 用于荧光细胞计数的照片对应的贴壁细胞面积，即 2cm2/（1.05mm×1.4mm）=136 荧光细胞数 × 每孔的视野数 = 每孔的荧光细胞总数

步骤：
1、准备 1 个 24 孔板的 293T 细胞，每孔的细胞融合度在 80％-90％之间，培养基为 DMEM + 10% FBS，1% Glutamax ，1% 青霉素-链霉素。293T 细胞 (ATCC No. CRL-11268) 必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率 90% 以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。
2、分别加入， 100ul,10ul,1ul,0.1ul 所收集的病毒液，体积小于 300ul 的用培养基稀释为 300ul, 并加入终浓度为 8μg/ml 的 polybrene，配制后的病毒液用于感染细胞。从培养箱中拿出细胞，首先观察细胞生长状态，如细胞状态良好则开始实验 。
 首先吸去细胞培养器皿中的培养基，然后加入稀释好的病毒液，轻轻摇晃混匀后放于二氧化碳培养箱（37℃、5%CO 2 ）孵育过夜。
注：感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大，所以务必保证加病毒之前细胞处于良好的生长状态 亦可以将预先准备好的培养基和慢病毒的混合液直接加入培养器皿中，在培养基中加入 ploybrene （8 μg/ml 左右）能提高病毒的感染效率。
3、第三天，更换培养液：一般在 24 小时候后将含有慢病毒的培养液更换成正常培养液；在感染后观察细胞状态，如果慢病毒对细胞有明显毒性作用而影响细胞生长状态，可以最短在加病毒 4 小时候更换新鲜培养液后继续培养（建议在 8-12 小时更换为宜） 。第一次换 液后，如果慢病毒对细胞没有明显毒性作用，按照正常培养条件培养换液。
4、感染后 72h，感染效率检测：在倒置荧光显微镜观察荧光，观察慢病毒载体携带的 GFP 绿色荧光蛋白，以观察病毒对目的细胞的感染情况，并拍照。
备注：
（1）计算显微镜下视野中阳性细胞的平均个数。选择一个梯度，此梯度视野中有 550 个阳性细胞，随机选择至少 5 个区域计数。
（2）计算 24 孔板中每孔视野的个数。对于多数显微镜，标准 10× 目镜与 10× 物镜所观察到的视野直径为 1.8mm，因此每个视野的面积 =3.14 x (D/2)2 = 3.14 x 0.92 = 2.54 mm2
对于一个标准 24 孔板，培养面积为 2.0cm2，因此每孔视野数 =2.0 cm2/2.54 mm2 = 2.0 cm2/2.54 x 10-2 cm2= 79，如果您不能确定您的物镜所观察到的视野直径或者您使用的不是 10× 物镜，视野直径可用血球计数板来确定。
 

（3）计算滴度。

滴度结果：
本次实验 ***-shRNA，***-shRNA，EGFP-NC 在显微镜下 1ul 中，EGFP-NC 病毒在 24 孔板中的的感染中，５个视野中计算的阳性细胞平均数约等于 500，*** 病毒在 24 孔板中的的感染中，５个视野中计算的阳性细胞平均数约等于 400， *** 病毒在 24 孔板中的的感染中，５个视野中计算的阳性细胞平均数约等于 300，
根据公式，病毒滴度 = 视野下荧光数 *79* 稀释倍偻 /0.0001ml

得出 EGFP-NC 病毒≈3.95*108  GFU/ml
***-shRNA 病毒≈3.16*108  GFU/ml
***-shRNA 病毒≈32.76*108  GFU/ml

滴度图片：
1ul

慢病毒的储存与稀释
慢病毒的储存
1、收到病毒液后若几天内用于实验，可于 4℃保存（于一周内用完）。
2、若病毒量较大，需长期保存。则根据每次实验用量分装后放于-80℃冰箱。一般病毒可以放于-80℃约 12 个月以上，但若超过 6 个月后使用，请重新检测病毒滴度。
3、避免反复冻融，否则会降低病毒滴度。每次冻融会降低病毒滴度 10%。
 
慢病毒的稀释
需要稀释病毒时，将病毒取出后置于冰上融解，用细胞培养用 D-Hank's、PBS 或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后 4℃保存，并尽快用于实验（于一周内用完）。
 
慢病毒在细胞水平的使用
什么是 MOI？
“MOI” 为”multiplicity of infection” 的缩写，中文为 “感染复数” 或 “复感染指数”，含义为感染时病毒和细胞数量的比值，即平均每个细胞感染的病毒活性单位数（TU number /cell）。在实验中将某种细胞感染达到 80% 时的 MOI 定义为这种细胞的 MOI。
MOI 与整合事件以及目的基因的表达相关。一定范围内，表达水平和 MOI 呈正相关。MOI 取决于多种因素，如细胞状态，目的基因的大小与性质，细胞的感染效率等。所以，实验前需查阅相关文献，确定慢病毒对目的细胞的亲嗜性、MOI 以及在体（in vivo）注射所需病毒量。若无文献支持，可以通过预实验得到合适的 MOI。实际上，即使有文献支持，但由于所用细胞代数、细胞状态以及目的基因的差异，实际的 MOI 和文献报道也会不同，所以要安排预实验以确定所需 MO  I 以及病毒对细胞生长的影响。

产品详见：https://www.biomart.cn/infosupply/97146008.htm